——習(xí)近平總書記在致中國科學(xué)院建院70周年賀信中作出的“兩加快一努力”重要指示要求
——中國科學(xué)院辦院方針
10月27日，國際學(xué)術(shù)期刊Advanced Science在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）代海強(qiáng)研究組聯(lián)合吳薇研究組的研究成果:”HTGTS‐TCR‐Seq for Profiling of Mouse and Human T‐Cell Receptor α and β Gene Rearrangements and Diversity”。該研究基于高通量全基因組易位測序(HTGTS)技術(shù)，開發(fā)了新型DNA測序方法HTGTS-TCR-seq，旨在精準(zhǔn)解析αβ T細(xì)胞受體（TCR）的重排過程。
TCR多樣性是適應(yīng)性免疫的核心，于T細(xì)胞發(fā)育過程中不同時(shí)期經(jīng)歷基因組V、D、J片段重排產(chǎn)生。Tcrb重排發(fā)生在DN3階段，通過RAG內(nèi)切酶催化斷裂一個(gè)D和一個(gè)J基因元件，進(jìn)而通過非同源重組末端連接（NHEJ）形成DJβ中間產(chǎn)物，再經(jīng)過RAG斷裂和NEHJ連接一個(gè)V基因元件，最終形成完整TCRβ。經(jīng)歷β-選擇后，T細(xì)胞由DN3發(fā)育至CD4+CD8+雙陽性(DP)階段，然后發(fā)生Tcra重排，由一個(gè)V和一個(gè)J基因元件連接形成完整TCRα。傳統(tǒng)TCR檢測方法主要依賴多重PCR和5'RACE等技術(shù)，然而mRNA水平的5'cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(5’RACE)受轉(zhuǎn)錄本豐度影響，且無法反映DNA水平的初始重排情況；DNA水平的多重PCR需大量特異性引物，始終存在引物偏倚。
在這項(xiàng)研究中，研究人員基于線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR技術(shù)(LAM-PCR)，通過對TCR基因片段進(jìn)行有限數(shù)量的引物設(shè)計(jì)，靶向TCR基因片段，從而直接捕獲基因組重排事件。該方法從源頭上規(guī)避了引物偏倚，實(shí)現(xiàn)在DNA層面可對重組效率、功能性與非功能性TCR重排的檢測分析。利用該體系，研究人員首先對小鼠胸腺細(xì)胞不同發(fā)育階段分析，結(jié)果顯示，DN3發(fā)育階段非功能性重組頻率較高，陽性選擇前的雙陽性胸腺細(xì)胞(preselection DP)功能性重組頻率較高，與理論預(yù)期高度吻合；雙陽性胸腺細(xì)胞在Tcra重排上呈現(xiàn)出階梯式重排特征，印證了連續(xù)發(fā)生的初級與次級重排事件模型。在年齡相關(guān)的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)衰老改變了Vα片段的使用偏好，這一趨勢在胸腺非成熟T細(xì)胞和外周成熟T細(xì)胞中均一致，提示小鼠中這一增齡性改變源于胸腺輸出環(huán)節(jié)。為了進(jìn)一步將方法應(yīng)用推廣至機(jī)制研究，研究人員對Wapl基因敲除的陽性選擇前的雙陽性胸腺細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)黏連蛋白卸載因子WAPL獨(dú)立于細(xì)胞分裂的作用影響Tcra基因重排。此外，研究人員通過對人源特異性引物設(shè)計(jì)，將應(yīng)用推廣至人類外周T細(xì)胞樣品上，展現(xiàn)出了臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的潛在價(jià)值。
綜上，這項(xiàng)研究建立了新型無偏倚的基因組TCR測序方法，揭示了發(fā)育階段特異性V/J片段使用規(guī)律及增齡性TCR變化，證實(shí)了該方法在人類樣本中具有同等應(yīng)用潛力，有望為T細(xì)胞發(fā)育、衰老和免疫相關(guān)疾病等研究提供新的視角。
分子細(xì)胞卓越中心代海強(qiáng)研究員和吳薇研究員為該論文共同通訊作者，博士研究生羅睿和宋亞偉為共同第一作者。博士研究生王美晨、鄒龍昊、焦芳太和楊天歌在數(shù)據(jù)處理和材料制備等方面也做出了重要貢獻(xiàn)。本研究得到了分子細(xì)胞卓越中心王廣川研究員和香港科技大學(xué)（廣州）梁卓毅教授的大力支持。項(xiàng)目獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、上海市基礎(chǔ)研究重大研究計(jì)劃、中國科學(xué)院國際伙伴計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金、表觀遺傳調(diào)控與干預(yù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題、本源公益基金等項(xiàng)目資助。研究工作還得到了本中心公共技術(shù)服務(wù)中心動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺、細(xì)胞分析技術(shù)平臺和分子生物學(xué)技術(shù)平臺的大力支持。特別感謝多細(xì)胞體系結(jié)構(gòu)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及沈義棟研究員提供衰老小鼠，感謝分子細(xì)胞卓越中心劉小龍研究員和南京大學(xué)華子春教授提供T細(xì)胞特異性工具鼠。
文章鏈接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202509497
HTGTS-TCR-seq技術(shù)示意圖
